B21

 

 

 

中华人民共和国农业行业标准

 

NY/T

 

 

 

 

 

 

 

 


甘蔗  种苗

Seedling of Sugarcane

 

 

(送    稿)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


中华人民共和国农业部
    

 

 

甘蔗种茎·········································································1

 

甘蔗脱毒种苗·····································································6


     

 

甘蔗是我国最重要的糖料作物,蔗糖是人民生活中必不可少的日常消费品。在生产上,甘蔗一般利用种茎进行无性繁殖,以保持品种基因型的稳定性。所以,种苗(茎)质量的优劣是实现高产、优质、低成本生产的重要物质基础。除作为制糖原料外,果蔗是一种产量高、生产容易、营养丰富、清凉爽口的大众化果品,深受消费者的喜爱。果蔗品种,如Badila(紫皮蔗)高感花叶病和宿根矮化病,病毒侵染造成产量和品质的下降,节间缩短,口感变劣,而脱毒甘蔗种苗则可以克服这些缺点。

随着农产品市场的进一步开放,优质优价的观念日益深入人心,对优质(脱毒)种苗的需求量增大。种苗市场秩序混乱,种苗质量良莠不齐,给生产造成较大损失。为了保护生产者、经营者的利益,确保甘蔗种苗质量,规范种苗市场,特制定本标准。

本标准甘蔗种茎部分的附录A、附录B、附录C以及甘蔗脱毒种苗部分的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G是标准的附录。

本标准由农业部市场与经济信息司提出。

本标准由农业部热带作物及制品标准化技术委员会归口。

本标准起草单位:农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心。

本标准主要起草人:陈如凯、林彦铨、张华、许莉萍。

本标准委托农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心负责解释。

 

 


               中华人民共和国农业行业标准

                                                            NY/T

                  

                            Sugarcane seed stem

 


1  范围

本标准规定了甘蔗种茎的定义、质量指标、检验、包装、运输和贮存。

本标准适用于甘蔗种茎的质量鉴定。

2  定义

本标准采用下列定义。

2.1 种茎

    甘蔗生长点以下带有健康、可萌发芽的蔗茎。生产上多指蔗梢部种茎。

2.2 品种纯度

    经确认的真实品种种茎数占种茎总数的百分率。

2.3 夹杂物

    种茎中夹带的蔗叶、已脱落的叶鞘、沙土、腐败茎及其他非蔗物。

2.4 夹杂物率

    夹杂物占种茎总重量的百分率。

2.5 茎径

    甘蔗节间中部的直径。

2.6 发芽率

    在气温20ºC以上,土壤最大持水量65%以上播种10天内的萌芽率。

2.7 生长裂缝

    节间中深入组织内部与节间平行的裂缝,也称水裂。

2.8 木栓斑块

    节间细而浅的裂痕归并而成斑块状。

2.9 蜡粉带

节间中叶痕下方的一层白色蜡粉形成的环状部分。

2.10 根点

生长带之下,叶痕之上的根带中散布的整齐或不整齐而成行的圆形或椭圆形小点。

2.11 芽沟

    节间着生芽的地方及其上方的一条凹入的纵沟。

-1-

3  质量指标

甘蔗种茎质量指标见表1

1  甘蔗种茎质量指标

   

            

品种纯度,%

100

夹杂物率,%

1

 

  径,㎝

大茎种

3.0

中茎种

2.5~3.0

细茎种

<2.5

含水量,%

50~85

发芽率,%

80

病虫害,%

5

4  检验

4.1 检验方法

4.1.1 同一批种茎一次性检测。种茎称重后人工随机抽样,从蔗捆中分散、均匀,每点抽取种茎一条,抽样重量不少于总重的千分之三。样本采集后,扎好,附送检卡,备检测品种纯度、茎径、含水量、发芽率、病虫害之用。

4.1.2 通过茎色、生长裂缝、木栓斑块、芽间10号毛群、侧芽、节间蜡粉、节间形状、节间排列、蜡粉带、根点排列、根点行数、芽形、芽沟、芽位、叶片茸毛、叶鞘颜色、叶鞘57号毛群、叶鞘包茎、叶耳形状、空心、蒲心情况的观察,依公式(1)计算种茎纯度。

    种茎纯度=(样本总数-误名种茎数)/样本总数×100%   1

4.1.3 用游标卡尺测量种茎的茎径。

4.1.4 种茎切段采用常压烘箱干燥,于90100oC烘干至恒重,依公式(2)计算含水量。

    种茎含水量=(烘干前重量-烘干后重量)/      烘干前重量×100%   2

4.1.5 通过砂培促芽,依公式(3)计算发芽率。

    种茎发芽率=萌芽数/总芽数×100%   3

4.1.6 观测有病虫害症状种茎的重量,依公式(4)计算病虫害率。

    病虫害率=有病虫害症状种茎的重量/种茎总重量×100%    4

4.1.7种茎称重后,随机采整捆种茎一捆,小心轻放,防止夹杂物脱落,附送检卡,依公式(5)计算夹杂物率。

    夹杂物率=夹杂物重量/种茎重量×100%    5

4.1.8检测结果记入附录A(标准的附录)规定的记录表中。

4.2 检验规则

4.2.1 检验甘蔗种茎限于种茎装运地或繁殖地进行。

4.2.2 种茎销售前,育苗单位应对种茎进行妥善保管和处理,防止病虫害的发生及蔓延。

-2-

4.2.3 种茎销售或调运时必须附有植物检疫证书、质量检验证书和标签。检验证书见附录B(标准的附录),标签见附录C(标准的附录)。

5  包装、运输、贮存

5.1 包装

    甘蔗种茎以2025㎏为一捆,用包装绳捆扎好,并挂上标签。

5.2 运输

    甘蔗种茎在运输装卸过程中,应注意防止种芽的损伤。

5.3 贮存

    砍收后的甘蔗种茎包装好后存放,上方可用覆盖物遮蔽,避免爆晒、积水或霜冻害,同时应注意防虫蛀。

 

 

                                

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

-3-


附录A

(标准的附录)

甘蔗种茎质量检测记录

 

 

           种: ___________________                   No__________________

       育苗单位: ___________________              购苗单位:__________________

       出圃数量: ___________________              抽检数量:__________________

  品种纯度%

夹杂物率%

茎径(cm)

含水量%

发芽率%

病虫害%

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

审核人(签字):          校核人(签字):           检测人(签字):          检测日期:         

-4-


附录B

(标准的附录)

甘蔗种茎质量检验证书

                                                                   No____________

   

 

 

 

 

 

 

 

注:本证一式三份,育苗单位、购苗单位、检验单位各一份。

审核人(签字):          校核人(签字):           检测人(签字):          检测日期:         

 

 

    C

(标准的附录)

甘蔗种茎标签

 

    甘蔗种茎标签见图C1

                                                             单位:cm

 

 О

 

     

品种名

 

 

 

 

      

              

 

               

 

 

 

 

O

О

育苗单位

 

合格证号

 

出圃日期

 

 

          

                 

 

              

 

 

注:标签用塑料纸,铅笔填写。

-5-

               中华人民共和国农业行业标准

                                                            NY/T

                   甘蔗脱毒种苗

                       Virus-free Seedling of Sugarcane

 


1  主题内容及适用范围

本标准规定了甘蔗脱毒种苗的定义、分级技术要求、检测方法、检测规则及包装、标志和运输方法。

本标准适用于各甘蔗品种脱毒种苗的质量鉴定。

2  定义

本标准采用下列定义。

2.1甘蔗脱毒种苗

指脱去本标准规定的检测对象的甘蔗种苗和组培苗,以及在不同隔离条件下逐代繁育并符合合格或合格以上标准的原原种、原种和生产用甘蔗种苗。

2.2甘蔗组织培养 

指利用甘蔗的器官、组织作为外植体,采用无菌操作接种于人工配制的培养基上,在一定的光照和温度条件下进行培养,使之生长、分化并发育成完整小植株的技术。

2.3外植体 

甘蔗组织培养的接种材料。

2.4培养基 

由水、无机盐类、有机物质、蔗糖、植物生长调节剂及琼脂等组成的培养基质。

2.5瓶苗 

在培养瓶中生长且已达到假植标准的根、茎、叶俱全的完整甘蔗小植株。

2.6袋装苗 

甘蔗瓶苗假植于盛有营养土的特定规格塑料袋或塑料盘中,并经精心管理所培育而成的可供大田定植的甘蔗组培苗。

2.7假植

从瓶苗移植于荫棚(苗圃)至袋装苗出圃之前的整个育苗过程。

2.8变异 

    在组织培养中受培养基和培养条件的影响,所培养出的甘蔗植株的遗传特性发生了变化,其形

-6-

 

态表现出有别于原品种植株的特征。主要表现为:白化、拔节或叶片畸形。

2.9带毒允许率

    指脱毒材料(瓶苗、袋装苗或种茎苗)中带毒材料允许的比率。

2.10带毒检出率

指甘蔗脱毒种苗中病毒或其它病菌阳性植株数占总检测植株数的百分率。

2.11热处理脱毒种茎

    指通过热水或热蒸汽处理甘蔗种茎而成。

2.12聚合酶链式反应

亦称PCR,是一种体外扩增特异核酸(DNA)片段的技术,是模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。

2.13指示植物 

    指对某种病毒反应敏感,症状明显,用以鉴定病毒种类的植物。

3分级技术要求

3.1甘蔗脱毒种苗的带毒允许率

凡指示植物、NCMELISAPCR检测呈阳性者为带毒种苗,各级种苗总带毒(标准中所列的四个检测对象)允许率如下:

种:带毒检出率为0.0%

    种:带毒检出率5.0%;

生产用种:带毒检出率≤10.0%;

根据检测结果填写检验报告,签发检验证书。(见附录A

3.2质量要求

在符合3.1的前提下,还应达到以下要求。

3.2.1甘蔗脱毒种苗种源来源清楚,品种纯正可靠,混杂率为0

3.2.2瓶苗

3.2.2.1培养基及材料真菌或细菌污染率不大于8.0%

3.2.2.2根系有主根及侧根,具有1.0cm以上的白色根不少于2条。

3.2.2.3株高不低于4.0cm,假茎有或无。

3.2.2.4完全展开叶不少于2片,叶色绿。

3.2.2.5生长正常无变异。

3.2.3袋装苗

3.2.3.1新出叶3~8片,叶色绿,不徒长。

3.2.3.2假茎高8.020.0cm,假茎粗不小于0.2cm

3.2.3.3根系生长良好。

3.2.3.4无检疫性病虫草害,非检疫性病虫害率不大于8.0%

3.2.3.5无明显可辩的变异株,大田种植后变异率小于5.0%

3.2.3.6出圃前一周应适当控水肥,并增加光照,使蔗苗健壮,以提高定植成活率。

3.2.4种茎苗

3.2.4.1未经热处理的有活力芽不少于85.0%,经热处理的种茎有活力芽不少于80.0%

3.2.4.2茎径不小于1.5cm

3.2.4.3种茎上病虫害率不大于10.0%

3.2.4.4种茎节间长度小于20.0cm

3.3甘蔗脱毒种苗分级

3.3.1在符合3.13.2的前提下,依有关指标把甘蔗脱毒种苗进行分级。

3.3.1.1瓶苗 据假茎有无、株高、白色根、完全展开叶、真菌或细菌污染率、总带毒率等六项指标,把瓶苗分为三个等级(见表1),并将结果记入附录B规定的记录表中,低于合格标准的瓶苗不得作为商品苗。

 

1           脱毒甘蔗瓶苗分级标准

 

 

一级

二级

合格

假茎

有(+

无(-

株高,cm

6.0

5.0

4.0

白色根,条

4

3

2

完全展开叶,片

4

3

2

真菌或细菌污染率,%

3.0

6.0

8.0

总带毒率,%

原原种为0.0,原种5.0,生产用种≤10.0

 

3.3.1.2袋装苗  据新出叶、假茎高、假茎粗、检疫性病虫草害、非检疫性病虫害率和总带毒率等六项指标,把袋装苗分为三个等级(见表2),并将结果记入附录C规定的记录表中,低于合格标准的袋装苗不得作为商品苗出圃。

 

2           脱毒甘蔗袋装苗分级标准

 

 

一级

二级

合格

新出叶,片

>6

4

3

假茎高,cm

15.020.0

10.020.0

8.020.0

假茎粗,cm

>0.4

0.3

0.2

非检疫性病虫害率,%

3.0

5.0

8.0

检疫性病虫草害,%

0.0

0.0

0.0

总带毒率,%

原原种为0.0,原种5.0,生产用种≤10.0

3.3.1.3种茎苗  据有活力芽的百分率、茎径、检疫性病虫草害、非检疫性病虫害率、节间长度和总带毒率等六项指标,把种茎苗分为三个等级(见表3),低于合格标准的种茎苗不得作为商品种茎苗。并将结果记入附录D表中。

3          甘蔗脱毒种茎苗分级标准

 

 

一级

二级

合格

未经热处理有活力芽,%

95.0

90.0

85.0

热处理有活力芽,%

90.0

85.0

80.0

茎径,cm

>2.2

1.8

1.5

节间长度,cm

<15.0

 <17.0

20.0

非检疫性虫害率,%

5.0

8.0

10.0

检疫性病虫草害,%

0.0

0.0

0.0

总带毒率,%

原原种为0.0,原种5.0,生产用种≤10.0

3.3.2定级时以达到各项指标中最低的一项来评定。

4        检测方法

4.1检测对象

4.1.1甘蔗花叶病毒 sugarcane mosaic virus,简称SCMV

4.1.2甘蔗褪绿线条病毒 sugarcane chlorotic streak virus,简称SCSV

4.1.3甘蔗宿根矮化病 sugarcane ratoon stunting disease, 简称RSD,(Clavibacter xyli subsp. xyli

4.1.4甘蔗白条病 sugarcane leaf scald,简称SLS,(Xanthomonas albilinean

4.2抽样

采用五点取样法。瓶苗以瓶为单位,在出厂前抽取;袋装苗以株为单位,在出圃前抽取;种茎苗以公顷(ha)为单位,在砍种前抽取;热处理脱毒种茎在种植后从田间抽取植株检验,以公顷为单位,各类脱毒种苗的抽样数量见表4

4     抽样数量标准

种苗种类

种苗总量(瓶、株或ha

抽样数量(瓶或株)

抽样最低数量(瓶、株)

 

瓶苗、袋装苗

5000

30

 

 

30

>5000,≤10000

40

>10000

50

种茎苗

(含热处理脱毒种茎)

2.0

150/ha

>2.0

100/ ha

4.3硝化纤维素膜酶联免疫(NCM-ELISA)检测法

    用于检测甘蔗花叶病毒、甘蔗宿根矮化病菌、甘蔗褪绿线条病毒和甘蔗白条病菌。检测方法见附录E

4.4聚合酶链式反应(PCR)检测法

用于检测甘蔗宿根矮化病菌和甘蔗白条病菌。检测方法见附录F

4.5指示植物检测法

用于检测甘蔗花叶病毒。指示植物为甜高梁RioSorghum bicolor cv. rio),症状:花叶、斑驳。检测方法见附录G

4.6瓶苗

4.6.1株高:用钢卷尺自基部(含长根部分)量至最高可见肥厚带处,株高不低于4.0cm

4.6.2白色根:用钢卷尺测量白色根的长度,记录不小于1.0cm长的白色根条数,白色根不少于2条。

4.6.3完全展开叶:用感官检测已完全展开的叶片,不少于2片。

4.6.4真菌或细菌污染率:用感官检测被真菌或细菌污染的瓶苗占总瓶苗的百分率,总污染率不大于8.0%

4.7袋装苗

4.7.1新出叶:用感官检测,自假茎基部往上检测瓶苗移栽后假植期间新长出的完全展开绿叶数,新出叶达38片。

4.7.2假茎粗:用游标卡尺测量自袋面以上2.0cm处的最粗直径,不小于0.2cm

4.7.3假茎高:用钢卷尺自袋面量至最新完全展开叶的肥厚带处,假茎高不低于8.0cm,不高于20.0cm

4.7.4病虫害率:用感官检测蔗株外表的病虫发生率,病虫害率应不大于8.0%

4.8种茎苗

4.8.1有活力芽:用感官和手检测有活力芽(芽色嫩绿、非暗绿)、手按不瘪,未经热处理的不少于85.0%,经热处理的不少于80.0%

4.8.2茎径:用游标卡尺测量留种部分下部的茎径,茎径不小于1.5cm

4.8.3病虫害率:用感官检测种茎外表的病虫发生率,病虫害率应不大于10.0%

4.8.4节间长度:用钢卷尺测量留种部分的下部节间长度,节间长度应不大于20.0cm

5        检测规则

5.1所有脱毒甘蔗种苗均应进行带毒率检测,检测方法中指示植物、NCMELISAPCR可任选其一。

5.2瓶苗作为商品苗出厂时,应出具甘蔗瓶苗检疫资料;袋装苗出圃前和种茎苗调运前,应按国家“植物检疫条例”,办理植物检疫证书,严禁有检疫对象的甘蔗种苗调入保护区。

5.3瓶苗的质量检测在出厂时进行,袋装苗的质量检验在出圃时进行,种茎苗的质量在砍种前进行。

5.4瓶苗质量由供需双方按标准进行检测,当质量上有异议时,可委托县级以上法定检测机构检测;由检测单位出具脱毒甘蔗种苗质量检测证书(见附录A)。

6        包装、标志、运输

6.1包装:甘蔗瓶苗如需调运,瓶苗仍保留在培养瓶或密封塑料袋中,并用纸箱或木箱包装;袋装苗可以木箱、塑料筐或纸箱包装,以不挤压箱中苗为度,且在装箱及运输途中,袋中土柱应较硬实,以不松散为度。种茎苗可用纸箱包装,也可直接捆扎堆于车箱中,但需通气,以防烂种。

6.2标志:为防止品种混杂,每车甘蔗种苗均须挂标签,注明品种、数量、供苗单位、出厂(圃)或砍种日期、级别、合格证号(见附录G)。若一车装有2个或2个以上品种,应按品种分别包装,分别装车,并做出明显标志。

6.3运输:调运途中应防日晒、雨淋,用有蓬车运输;当运输到目的地后即卸苗,并置于荫棚或阴凉处;瓶苗尽早假植,袋装苗尽早定植,种茎苗尽早育苗。

 


附录A

(标准的附录)

                 脱毒甘蔗种苗质量检测证书                №:          

 

供苗单位

 

购苗单位

 

品种名称

 

种苗种类

 

种苗数量

 

总带

 

检测结果

其中一级:           二级:             合格:

检测意见

 

证书签发日期

 

证书有效日期

 

注:本证一式三份,供苗单位、购苗单位、检测单位各一份。

审核人(签字):            校核人(签字):             检测人(签字):            检测日期:     

 

 

 

 

 

 

附录B

(标准的附录)

脱毒甘蔗瓶苗质量检测记录表

 

品种名称:

 

购苗单位:

 

供苗单位:

 

检测单位:

 

瓶苗总数:

 

抽检瓶数:

 

                                                                  №:         

样瓶号

假茎

株高(cm)

白色根(条)

完全展开叶(片)

真菌或细菌

污染率(+/-)

带毒

+/-)

初评级别

总 评

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

审核人(签字):            校核人(签字):             检测人(签字):        检测日期:     

-11-


附录C

(标准的附录)

脱毒甘蔗袋装苗质量检测记录表

 

品种名称:

 

购苗单位:

 

供苗单位:

 

检测单位:

 

袋苗总数:

 

抽检袋数:

 

                                                                  №:         

样株号

假茎高(cm)

假茎粗(cm)

新出叶(片)

检疫性病虫草害(+/-)

非检疫性病虫害(+/-)

带毒(+/-)

初评级别

总评

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

审核人(签字):            校核人(签字):             检测人(签字):            检测日期:     

附录D

(标准的附录)

脱毒甘蔗种茎苗质量检测记录表

 

品种名称:

 

购苗单位:

 

供苗单位:

 

检验单位:

 

种茎总数:

            

抽检芽数:

 

经热处理(是/否)                                                  №:         

样株号

芽活力(有/无)

茎径(cm)

节间长度(cm)

检疫性病虫草害(+/-)

非检疫性病虫害(+/-)

带毒(+/-)

初评级别

总评

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

审核人(签字):            校核人(签字):             检验人(签字):           检测日期:     

-12-

附录E

(标准的附录)

硝化纤维素膜检测法

 

E1 溶液配制

E1.1 TBSpH7.6

Tris Base             4.84g

NaCl                58.44g

NaN3                0.40g

溶于1950mL蒸馏水中,用HC137%)调pH7.5,定容至2000mL

E1.2洗涤缓冲液(TTBS

    1.0mL Tween-20加入2000mL TBS中。

E1.3抽提缓冲液

500 mL TBS缓冲液中加入1.0 g Na2SO3

E1.4封闭缓冲液(现用现配)

脱脂奶粉          0.50g

Triton X-100       0.50mL

TBS              25mL

先将脱脂奶粉溶解于少量TBS中,再用TBS定容至25mL。最后加入Triton X-100混合均匀。

E1.5抗体缓冲液

脱脂奶粉          1.00g

TBS              50mL

E1.6底物缓冲液(pH9.5

Tris Base          6.05g

NaCl             2.92g

MgCl2·6H2O     0.51g

NaN3             0.40g

以上各物质溶于450mL蒸馏水中,用浓盐酸调pH值至9.5,再加蒸馏水定容至500mL

E1.7 NBTBCIP储备液

    A  NBT储备液

硝基蓝四唑盐(NBT    40mg

70% 二甲基甲酰胺       1.2mL

混合均匀,4避光保存。

B  BCIP 储备液

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5--4--3-吲哚磷酸酯(BCIP 20mg

70% 二甲基甲酰胺             1.2mL

混合均匀,4℃避光保存。

E1.8底物溶液(现用现配)

底物缓冲液                   25mL

NBT储备液                  75μl

BCIP储备液                 75μl

先将NBT储备液与底物缓冲液混匀,再逐滴加入BCIP储备液,边加边振摇混匀。

E2 样品制备

    将待测叶片(采后24小时内完成)用清水洗干净,每份样品各从三张叶片上取一直径约1cm圆片(共3片),将圆片放回塑料样品袋中。提取时取出并置于研钵中,加入3mL抽提缓冲液(每个叶片用1mL)充分研磨,转移至塑料管中,于4℃下竖直静置30~40分钟,取澄清汁液点样。样品为种芽时催芽后取幼芽制样。

E3 操作步骤

E3.1点样:将打好方格的硝化纤维素膜放在干燥、洁净的滤纸上,用干净已灭菌的微量移液器取上清液点样,每个样品17µL,点在膜上方格的正中,点后干燥1530min,设2次重复。并设阳性、阴性和空白对照。

E3.2 封闭:将干燥后的膜浸泡在封闭缓冲液中,室温下摇床振荡(50rpm1h

E3.3孵育第一抗体:用抗体缓冲液稀释抗血清至工作浓度,将膜置于其中,室温下摇床振荡(50rpm)过夜。

E3.4洗涤:用洗涤缓冲液洗膜3次,每次摇床振荡(100rpm3min

E3.5孵育第二抗体:用抗体缓冲液稀释酶标抗体至工作浓度,将膜置于其中,室温下摇床振荡(50rpm1h

E3.6洗涤:洗涤4次,方法同E3.4

E3.7显色:将膜置于NBT/BCIP底物溶液中,室温下摇床振荡(50rpm)孵育30min

E3.8终止反应:弃去底物溶液,并用蒸馏水洗膜3次,每次摇床振荡(100rpm3min

E3.9阳性判断:晾干后观察颜色反应,出现兰紫色反应的样品为阳性。

 

 

 

 

 

 

 

 

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附录F

(标准的附录)

聚合酶链式反应(PCR)检测法

 

F1甘蔗宿根矮化病菌检测

F1.1引物

L1:5’ CAAGGCATCCACCGT 3’

G1:5’ GAAGTCGTAACAAGG 3’

F1.2 PCR反应混合液

DNA              20ng

引物              每种各1µmol.L-1

10×PCR缓冲液    2.5µmol.L-1

Taq             1U

Mg2+              2.0mmol.L-1

反应总体积为25µL,各成份混合后不够部分用无菌双蒸水补足。

F1.3 DNA扩增

采用如下PCR循环程序进行DNA扩增。

95℃预变性4min

40个循环    94℃,30

            50℃,30

            72℃,60

72℃延伸5min后,取出置4℃,待分析。

F1.4 PCR产物电泳

0.5×TBE缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶,内含0.5mgL-1EB。按1:5(上样液:PCR产物)比例混合后点样。在10.0Vcm-1的恒压下电泳,电泳缓冲液为0.5×TBE。上样液含0.25%溴酚蓝和40%W/V)蔗糖水溶液。用PCR marker作为分子量对照。电泳结束后在紫外透射仪或胶自动扫描仪上观察。

F1.5 TBE

1×TBE:每1000mL9.0g Tris5.5g硼酸,0.5mol.L-1 EDTApH8.04mL,加双蒸水至1000mL,或再加1000mL双蒸水稀释成0.5×TBE

F1.6 0.5molL-1 EDTApH8.0

186.1g EDTA·Na2·2H2O溶于800mL双蒸水中,用NaOH调节pH值至8.0,加水定容至1000mL后于121℃高压灭菌20min。

F1.7阳性判断

根据PCR产物大小判断,凡产物大小约560bp即视为阳性。

F2  甘蔗白条病菌检测

F2.1引物

L1:5GGGGGTTCGAATTCCCGCCGGCCCCA 3

G1:5ATGCTCTACCAACTGAACT 3

F2.2 PCR反应混合液

F1.2

F2.3 DNA扩增

F1.3

F2.4 PCR产物电泳

    同F1.4

F2.5 TBE

F1.5

F2.6 0.5mol.L-1 EDTApH8.0

F1.6

F2.7阳性判断

根据PCR产物大小判断,凡产物大小约170bp即视为阳性。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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附录G

(标准的附录)

指示植物检测法

 

G1繁育指示植物

25左右,防虫条件下种植甜高梁,至1~2片完全展开叶时接种。

G2接种

以待测样品叶片提取液,摩擦接种于甜高梁叶片上。方法是:以手沾提取液,轻捏甜高梁叶片造成伤口,保温过夜,每个样品重复接种3株,同时设阳性对照、阴性对照。接种后置防虫室,常规管理。

G3阳性判断

根据指示植物症状,确定有无甘蔗花叶病毒。只要有一株指示植物表现系统症状,即视为阳性。

G4缓冲液的配制及提取液的制备

G4.1 0.01mLL-1 PBSpH8.0

Ⅰ液:Na2HPO4·12H2O 35.8g

      加蒸馏水      1000mL

Ⅱ液:NaH2PO4·2H2O  13.9g

      加蒸馏水      1000mL

将Ⅰ液39mL与Ⅱ液61mL混合后,再加蒸馏水至1000mL,然后用NaOH调至pH8.0即可。

G4.2提取缓冲液

    0.01molL-1 PBSpH8.01000mLNa2SO3 1.0g

G4.3提取液制备

    取待测样品新伸长叶片10g,加提取缓冲液10mL,经捣碎、榨汁后即成。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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